天正二年，信長在岐阜本居城內歡慶新年的同時，並沒有忘記心中的一件大事：伊勢的長島一揆發動暴亂，距今已經是第四個年頭了。信長幾次派兵圍剿，均遭到長島軍頑強的抵抗。
元龜元年（1570年）九月十二日，長島一揆接到將軍義昭的秘密指令後，立即起兵反抗信長。四年來，信長的弟弟信興、同族卜全，相繼戰死在征討長島軍的戰役中。長島軍堅持頑強抵抗，給予織田軍沉重的側面打擊。
同時起兵的不光是長島一揆，還有武田信玄、淺井、朝倉、六角、三好三人眾等，他們共同結成反信長戰線大聯盟。但隨著信玄的病逝，反信長陣營聯盟相繼崩潰。後來由於義昭的周旋調解，信長同本願寺達成和議。長島軍現已完全孤立無援，總攻擊的時刻終於到來了。
長島一揆的主力，是以願證寺為中心的本願寺眾門徒。散居在木曾川一帶的他們全民皆兵，憑藉地利優勢，多年來給予了織田軍沉重的打擊。
和織田正規軍相比，他們只是一群裝備粗糙的普通男女老百姓而已。但在宗教的信仰魔力下，本願寺眾門徒視死如歸，不畏強敵，誓同信長軍死戰到底。
糧食吃光後，他們就用草根，觀音土充飢。雖然一個個都如地獄幽魂般骨瘦如柴，但戰鬥力之堅強，比起戰神金剛亦毫不遜色！
信長軍曾經兩次被以農民為主力的長島雜牌軍擊退。身經百戰的織田軍將領認為，他們的作戰對手絕非人類，而是從異界降臨人間的妖怪！提起本願寺眾門徒，織田軍無論兵將，臉上都寫滿了恐懼與驚慌。
但隨著反信長陣線聯盟的徹底崩潰，信長有足夠把握相信：此番必能將長島雜牌軍一舉殲滅。天正二年七月，信長親率十萬大軍，浩浩蕩盪殺向長島，發動第三次，也是最後的一次攻擊。
這次志摩九鬼氏水軍的加盟，更使織田軍如虎添翼。信長先是命令水軍封鎖海面，八月三日，又命織田軍用大砲摧毀了大鳥居、筱橋一帶的長島軍兵砦。
願證寺眾門徒提出投降，但被信長拒絕了。
“無論男女老幼，悉數殺盡！”信長命令道。
九月末，長島、屋長島、中江相繼開城，無條件投降。眾門徒欲乘船逃跑，信長命砲隊亂射，頃刻間悉數殺光逃徒。
同時，信長又將中江、屋長島兩城內沒來得及逃走的男女老幼二萬人，都趕至一處，周圍圈上木柵，四方引火全部燒殺。對待手無寸鐵的百姓，信長竟如此慘無人道。真如白河詩中所言，是名副其實的“天魔惡鬼”。
在沒有機關槍和毒氣瓦斯的時代，織田軍竟然能一次屠殺二萬人之多。除了滅絕人性，實在找不到更好的詞彙用來形容信長。
對於這個駭人聽聞的殘酷場面，《信長公記》中記述的卻是異常簡潔：
“公（信長）令將兩城男女聚集一處，四方舉火燒殺。九月二十九日，公率大軍順利返回岐阜。”
長島一揆滅亡後，本願寺如同拔去足腳的螃蟹。他們以第二次講和的形式向信長徹底投降。至此，信長終於可以全力以赴對付自己最大的敵人—武田家。
信玄病逝後，嗣子武田勝賴繼位，繼續向遠江進行勢力浸透的同時，和德川家康的對立也愈發深刻。
信玄死後，長舒一口氣的信長沒高興多久，就不得不承認武田家新繼位的勝賴，絕對不是非同一般的武將。
勝賴於信玄死後潛心守制，給群雄造成假象：他是一個沒有遠大抱負，和義景一樣懦弱的膽小武將。
德川家康也趁這期間繼續將勢力由遠江向駿河一帶滲透，逐步擴大自己的版圖範圍。
但這種假象並未能維持多久。天正一年十一月，信玄滿喪不久，勝賴即率武田軍團由駿河侵入遠江、三河一帶。天正二年一月，勝賴進攻美濃，攻陷明智城。五月，進軍遠江，攻陷高天神城。
從地形上來看，高天神城地處德川喉頸，具有重要的戰略地位。在信長看來，高天神城易守難攻，即使信玄在世亦不能如此乾淨利索的攻下此城。而勝賴竟然能做得到，可見他絕非一般武將所能比擬。
武田軍一舉攻陷高天神城之後，諸方大名的目光同時聚集在勝賴身上。
勝賴攻陷高天神城，對家康構成重大威脅的同時，信長亦將他列為與其父信玄同等實力的強敵，密切地關注勝賴的一舉一動。
這期間勝賴曾接到本願寺發來的長島救急要請，但由於家康的阻攔，未能派兵援助。這使他領悟到：欲繼承父親遺誌上京勤王，信長和家康都是自己此後很長一段時間內主要的對手。
無論取得多麼大的勝利，倘若只是在日本中央山岳地帶耀武揚威的話，必將成不了大氣。沒有把禦旗和楯無（武田家象徵物）帶入京城之前，勝賴只不過是一個霸氣的“山大王”而已。
絕非尋常武將的勝賴，在父親信玄遺留的基礎上，開始逐步實現其龐大的野心。